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編輯：錢亞如
隨著免疫學(xué)技術(shù)及全自動(dòng)生化分析儀技術(shù)的日趨完善，免疫透射比濁法試劑在全自動(dòng)生化儀上應(yīng)用逐漸成熟。由于該方法操作簡便、自動(dòng)化和高穩(wěn)定性使其成為目前臨床生化檢測中最常用的技術(shù)之一。 大量的以往依靠專用免疫學(xué)檢測儀器執(zhí)行的檢測項(xiàng)目也逐步轉(zhuǎn)移到全自動(dòng)生化儀上完成。為幫助基層試驗(yàn)室操作者對相關(guān)知識(shí)的了解，并正確開展相關(guān)檢測，特對免疫透射比濁法原理、主要影響因素和應(yīng)用注意事項(xiàng)等知識(shí)進(jìn)行簡單介紹。
1.免疫透射比濁法原理
免疫透射比濁法的原理是：可溶性抗原抗體在液相中特異結(jié)合產(chǎn)生一定大小的復(fù)合物，當(dāng)一束光線通過這些復(fù)合物時(shí)，在1800角（即在直射角度）上測定光透射強(qiáng)度，由于復(fù)合物的散射和遮擋，致使透光度減弱（見圖1）。在一定條件下透射光減弱的程度（吸光度的增加）和液相中復(fù)合物的量成比例從而得出被測溶液中抗原或抗體的濃度[1]。
圖1. 免疫透射比濁法原理示意圖
2.免疫透射比濁法改進(jìn)
長期以來，人們普遍認(rèn)為免疫透射比濁法的敏感性不夠理想，檢測范圍不夠?qū)挘蚴敲庖邚?fù)合物顆粒太小，阻擋不了光線的通過；或是免疫復(fù)合物的數(shù)量太少，其濁度變化對光通量的透過影響不大，特別是在低濃度時(shí)更加明顯[2]。
近年來，發(fā)展起來的膠乳增強(qiáng)免疫透射比濁法（Particle Enhanced Turbidimetric Assay，簡稱：PETIA 或Latex Enhanced Turbidimetry）大大緩解了這一難題[3-5]。該方法是將抗體連接在微小的膠乳顆粒（粒子直徑從20nm－4μm）上，當(dāng)抗原抗體相結(jié)合時(shí)便形成了抗原-抗體-膠乳顆粒復(fù)合物，檢測的靈敏度得到了極大的改善，檢測靈敏度最高可達(dá)到1.0ng/ml，可以作為多克隆抗體和單克隆抗體的載體。納米級粒子的推出解決了對單克隆抗體結(jié)合的能力不強(qiáng)，臨床檢測的線性范圍窄，干擾因素多，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性差等問題，大大促進(jìn)了免疫比濁法在臨床上的廣泛應(yīng)用。
特別是雙膠乳顆粒連接的雙抗體技術(shù)（DuREL，dual radius latex enhanced technology）最近也得以應(yīng)用于免疫透射比濁法，其中大膠乳顆粒包被了高反應(yīng)性抗體，以提高分析敏感性；小膠乳顆粒包被了低反應(yīng)性抗體，以此來擴(kuò)展測量范圍，使得檢測敏感性及檢測范圍大大改善[2]。以C 反應(yīng)蛋白( CRP) 試劑盒為例，第1代試劑為傳統(tǒng)的免疫透射比濁法，其檢測范圍為5～250 mg /L； 第2 代試劑采用PETIA法制備的超敏CRP，其檢測靈敏度可達(dá)0.3mg/L；而第3 代試劑則為雙膠乳顆粒連接的雙抗體技術(shù)（全程CRP），其檢測范圍為0.3～350 mg /L，分析敏感性與測量范圍均大大增加。
PETIA檢測試劑所采用的乳膠顆粒多為惰性微球、羧基化微球及氨基化微球。表面修飾的膠乳粒子與抗體的結(jié)合是通過其表面的羧基或氨基與抗體的氨基端共價(jià)結(jié)合，在微球與抗體之間有一個(gè)橋聯(lián)化學(xué)臂，降低了位阻效應(yīng)，不僅提高了抗體的結(jié)合率，而且還為抗體提供合適的三維空間立體結(jié)構(gòu)，有效地保護(hù)了抗體與抗原結(jié)合的活性區(qū)域。國外已有多家公司提供納米級表面修飾的微球粒子原料，并廣泛應(yīng)用于PETIA。
3. 免疫透射比濁法檢測的主要影響因素
免疫比濁法檢測都是通過抗原抗體的結(jié)合來測定樣品中待測物質(zhì)的濃度的，那其必然受到抗體（或抗原）、緩沖系統(tǒng)和波長的影響。下面就這些主要因素進(jìn)行介紹。
3.1 抗體（或抗原）的質(zhì)量
免疫濁度測定對抗體的質(zhì)量要求較高，抗體要特異性強(qiáng)，即只與相應(yīng)抗原反應(yīng)，與其他抗原絕無交叉反應(yīng)。且效價(jià)高，大于1:20，親和力強(qiáng)，這樣可加快抗原、抗體反應(yīng)，使抗原、抗體復(fù)合物牢固不易解離[6]。因此，可以說擁有的抗
體質(zhì)量是決定比濁結(jié)果的重要原因�？乖涂贵w的制備，無論是使用抗原作為試劑檢測待測標(biāo)本中的特異性抗體，如測定抗鏈球菌溶血素 “O”；還是使用抗體作為試劑檢測待測標(biāo)本中的抗原，如各種特定蛋白，都要求它們達(dá)到一定的純度，具有特異性和反應(yīng)的專一性。單克隆抗體的特異性顯然遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于多克隆抗體，基因工程制備的第三代抗體，又比通過生物學(xué)方法制備的抗體要好[7]。
3.2 抗原抗體的比例
在免疫濁度測定中，免疫復(fù)合物微粒的大小與反應(yīng)體系中抗原、抗體的比例關(guān)系密切，抗原、抗體的比例是濁度形成的關(guān)鍵因素。當(dāng)抗原、抗體比例恰當(dāng)時(shí)，二者全部結(jié)合，既無抗原過剩，又無抗體過剩，這時(shí)免疫復(fù)合物的形成和解離達(dá)到平衡。當(dāng)抗原過量時(shí)，形成的免疫復(fù)合物分子小，而且會(huì)發(fā)生再解離，使?jié)岫确炊陆�，光散射減少，形成高劑量鉤狀效應(yīng)圖。當(dāng)抗體過量時(shí)，復(fù)合物的形成隨著抗原量的增加而增加，當(dāng)抗原、抗體比例達(dá)到最佳時(shí)免疫復(fù)合物的量達(dá)到高峰，這就是經(jīng)典的Heidelberger曲線理論圖（見圖2）。為此，免疫比濁法的基本原則就是在反應(yīng)體系中保持抗體過量，如抗原過量則引起測量失敗。
圖2. Heidelberger曲線理論圖
3.3 緩沖系統(tǒng)
1、PH值�？乖贵w一般需要相對溫和PH。pH6.5—8.5時(shí)抗原、抗體親和力大，超過這個(gè)范圍不易形成免疫型復(fù)合物，甚至可引起免疫復(fù)合物解離；pH太高或太低易引起蛋白質(zhì)變性，形成偽濁度。
2、離子強(qiáng)度。電解質(zhì)的性質(zhì)和強(qiáng)度影響免疫復(fù)合物的形成和穩(wěn)定性：離子濃度可以直接影響Ag和Ab的結(jié)合。在一定范圍內(nèi)，離子強(qiáng)度大，免疫復(fù)合物形成快。但離子強(qiáng)度過高可引起蛋白質(zhì)鹽析，形成偽濁度。離子的種類也可影響復(fù)合物的形成，由慢到快可按順序排列為：SCN-、c1O4、Cl、F、SO2-、H2PO4-、HPO42-。因此，常用磷酸鹽緩沖液作為免疫濁度測定的反應(yīng)液。
3、入射光波長。無論是透射比濁還是散射比濁，入射光波長均影響濁度測定的靈敏度。若血清成分能吸收部分入射光，透射比濁法會(huì)誤測為抗原的高濃度，散射比濁法會(huì)誤測為抗原的低濃度。因此濁度測定的波長選擇很重要，以江蘇英諾華醫(yī)療技術(shù)有限公司生產(chǎn)的D系列全自動(dòng)生化儀為例，普通免疫比濁法的波長一般選擇340nm；而膠乳增強(qiáng)免疫比濁法的波長根據(jù)抗體交聯(lián)的膠乳大小選擇不同波長，通常會(huì)選擇578nm、620nm或670nm。
4、偽濁度。指非待測抗原、抗體特異結(jié)合生成的免疫復(fù)合物形成的濁度，可導(dǎo)致抗原檢測結(jié)果假性升高。偽濁度形成的原因有標(biāo)本混濁、高血脂、標(biāo)本長期保存或反復(fù)凍融，處理不當(dāng)；試劑中抗體效價(jià)低于1:20可導(dǎo)致偽濁度增加；抗血清含有交叉反應(yīng)性抗體，聚乙二醇(PEG)濃度過高引起血清中雜蛋白的非特異性共沉淀，濁度增加[8]；試劑污染(如細(xì)菌)和變質(zhì)；器材不夠清潔，尤其是比色杯、塵埃污染等；其他因素還有緩沖液的離子類型與強(qiáng)度、pH值及反應(yīng)溫度等都會(huì)對濁度形成影響。
4．免疫透射比濁法的特定和臨床應(yīng)用
近年來，免疫透射比濁法自身改進(jìn)使其在生化分析儀上得到廣泛的應(yīng)用。其主要的優(yōu)點(diǎn)有一下幾個(gè)：
1、抗干擾能力強(qiáng)：免疫復(fù)合物、免疫球蛋白聚集、脂蛋白以及膽紅素或游離血紅蛋白等都可對光散射或光透射分析結(jié)果產(chǎn)生干擾。而免疫透射比濁法所采用的全自動(dòng)生化分析儀可聯(lián)合應(yīng)用雙波長檢測，輔助檢測點(diǎn)的設(shè)置，樣本自動(dòng)稀釋，與樣本空白對照檢測，有助于最小化這些因素對檢測的影響。因此，免疫透射比濁法的抗干擾能力較強(qiáng)[2]。
2、操作方便：可應(yīng)用于全自動(dòng)生化儀。自動(dòng)化程度高，操作簡便，儀器技術(shù)成熟，穩(wěn)定性好，檢測結(jié)果10min內(nèi)得到。
3、成本低，易普及：免疫透射比濁法的試劑相對成本較低，且試劑開啟后穩(wěn)定，校準(zhǔn)周期較長，故總體消耗成本較低。
綜上所述，，免疫透射比濁法具有更優(yōu)的精密度、相似的分析敏感性和檢測范圍、良好的相關(guān)性、較小的系統(tǒng)誤差、較強(qiáng)的抗干擾能力，且更加實(shí)用和便利，、適合各種有全自動(dòng)生化分析儀的醫(yī)院，完全符合實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測的要求。因此，免疫透射比濁法在臨床實(shí)驗(yàn)室中具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值與優(yōu)勢[9]。
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