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編輯：虞鳳
1.免疫熒光技術(shù)的概念
免疫熒光技術(shù)（Immu nofluorescence technique）又稱(chēng)熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展最早的一種[1]。將抗原或抗體用熒光素進(jìn)行標(biāo)記，標(biāo)記的抗原或標(biāo)記的抗體與相應(yīng)的抗體或抗原反應(yīng)后，測(cè)定復(fù)合物中的熒光素，這種免疫技術(shù)稱(chēng)為免疫熒光素技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心法、間接法和補(bǔ)體法。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分作若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無(wú)放射性污染,并且大多操作簡(jiǎn)便,便于推廣[2]。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問(wèn)題,熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。近年來(lái)發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。
2.熒光免疫技術(shù)的原理
免疫熒光技術(shù)的基本原理就是將熒光物質(zhì)與待測(cè)物通過(guò)化學(xué)反應(yīng)以共價(jià)鍵連接，通過(guò)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、流式細(xì)胞儀等儀器的檢測(cè)，達(dá)到定位、示蹤、含量測(cè)定等目的，并被廣泛地應(yīng)用于生物化學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)、病理學(xué)和診斷學(xué)等方面。
3.熒光免疫技術(shù)分類(lèi)
（1）熒光抗體顯微鏡技術(shù)：抗原抗體反應(yīng)后，利用熒光顯微鏡判定結(jié)果的檢測(cè)方法。
（2）免疫熒光測(cè)定技術(shù)： 抗原抗體反應(yīng)后，利用特殊儀器測(cè)定熒光強(qiáng)度而推算被測(cè)物濃度的檢測(cè)方法
4.熒光標(biāo)記
熒光物質(zhì)受到紫外光或藍(lán)紫光照射時(shí)，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當(dāng)激發(fā)態(tài)恢復(fù)至基態(tài)時(shí)，發(fā)出熒光。熒光的特點(diǎn)是靈敏、特異、準(zhǔn)確、快速�？捎糜跇�(biāo)記的熒光素有：異硫氰酸熒光素(FITC )、四乙基羅丹 明(RIB200)和四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC )，其中應(yīng)用最廣的是FITC”。對(duì)于熒光標(biāo)記示蹤的原理，目前常見(jiàn)的有以下兩種情況：一是利用環(huán)境的差異而引起熒光物質(zhì)的熒光發(fā)生變化，觀測(cè)這種變化，間接的達(dá)到示蹤目的，如：4-十七烷基-7-羥基香豆素是一種pH敏感的熒光探針，主要作用于細(xì)胞膜表面，隨著細(xì)胞所處環(huán)境pH的改變而引起熒光強(qiáng)度的變化，觀測(cè)這種變化，可以研究陽(yáng)離子脂類(lèi)與細(xì)胞膜的作用；二是用熒光物質(zhì)標(biāo)記所要研究的物質(zhì)，通過(guò)監(jiān)測(cè)熒光物質(zhì)達(dá)到靶向追蹤的目的。
5.熒光抗體技術(shù)
5.1標(biāo)本的制備
熒光抗體技術(shù)主要靠觀察切片標(biāo)本上熒光抗體的染色結(jié)果作為抗原的鑒定和定位。因此標(biāo)本制作的好壞直接影響到檢測(cè)的結(jié)果。在制作標(biāo)本過(guò)程中應(yīng)力求保持抗原的完整性，并在染色、洗滌和封埋過(guò)程中不發(fā)生溶解和變性 ，也不擴(kuò)散至臨近細(xì)胞或組織間隙中去。標(biāo)本切片要求盡量薄些，以利抗原抗體接觸和鏡檢。標(biāo)本中干擾抗原抗體反應(yīng)的物質(zhì)要充分洗去，有傳染性的標(biāo)本要注意安全。
常見(jiàn)的臨床標(biāo)本主要有組織、細(xì)胞和細(xì)菌三大類(lèi)。按不同標(biāo)本可制作涂片、印片或切片。組織材料可制備成石蠟切片或冷凍切片 。石蠟切片因操作煩瑣，結(jié)果不穩(wěn)定，非特異反應(yīng)強(qiáng)等已少應(yīng)用。組織標(biāo)本也可制成印片，方法是用洗凈的玻片輕壓組織切面，使玻片粘上 1～2層組織細(xì)胞。細(xì)胞或細(xì)菌可制成涂片，涂片應(yīng)薄而均勻。涂片或印片制成后應(yīng)迅速吹干、封裝，置-10℃保存或立即使用。
5.2熒光抗體染色
于已固定的標(biāo)本上滴加經(jīng)適當(dāng)稀釋的熒光抗體 ，置濕盒內(nèi)，在一定溫度下溫育一定時(shí)間，一般25℃-37℃30min不耐熱抗原的檢測(cè)則以4℃過(guò)夜為宜,用PBS充分洗滌,干燥。
6.熒光免疫技術(shù)的臨床應(yīng)用
6.1熒光抗體技術(shù)的應(yīng)用
自身抗體檢測(cè) 熒光抗體技術(shù)可用于檢測(cè)血清抗核抗體、抗平滑肌抗體、抗線粒體抗體等自身抗體，輔助診斷自身免疫性疾病。
病原體檢測(cè) 熒光抗體技術(shù)可快速鑒定病原體并可檢測(cè)血清中抗體，用于疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查和臨床回顧診斷。
免疫病理檢測(cè) 熒光抗體技術(shù)可用于組織中免疫球蛋白、補(bǔ)體和抗原抗體復(fù)合物的檢測(cè)及腫瘤組織中腫瘤特異性抗原的鑒定。
細(xì)胞表面抗原和受體檢測(cè) 熒光抗體技術(shù)可用于淋巴細(xì)胞表面CD抗原、抗原受體、補(bǔ)體受體、Fc受體等的檢測(cè)以及淋巴細(xì)胞及其亞群的鑒定和計(jì)數(shù)。
熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析。在這種分析法中檢測(cè)儀器不是熒光顯微鏡，檢測(cè)對(duì)象不是固定了的標(biāo)本，而是將游離細(xì)胞作熒光抗體特異染色后，在特殊設(shè)計(jì)的儀器中通過(guò)噴嘴逐個(gè)流出，經(jīng)單色激光照射后發(fā)出的熒光信號(hào)由熒光檢測(cè)計(jì)檢測(cè)，并自動(dòng)處理各種數(shù)據(jù)。
6.2 熒光免疫測(cè)定的應(yīng)用
目前，時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定、熒光偏振免疫測(cè)定和熒光酶免疫測(cè)定都有全自動(dòng)化測(cè)試的分析儀器，這些儀器具有試劑和樣本條碼識(shí)別系統(tǒng)，能自動(dòng)加樣、溫育、洗滌、分離、測(cè)定熒光強(qiáng)度、處理數(shù)據(jù)和報(bào)告結(jié)果。
時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定應(yīng)用范圍十分廣泛，包括蛋白質(zhì)、激素（肽類(lèi)激素、甲狀腺激素、類(lèi)固醇激素等）、藥物、腫瘤標(biāo)志物、病原體抗原／抗體等；熒光偏振免疫測(cè)定特別適用于血清或尿液中小分子物質(zhì)的測(cè)定，目前已有數(shù)十種治療藥物和成癮藥物、維生素、激素及常規(guī)生化項(xiàng)目可用熒光偏振免疫測(cè)定進(jìn)行分析和定量測(cè)定；熒光酶免疫測(cè)定可用于多種抗原抗體的檢測(cè)，如病毒抗體、細(xì)菌及毒素抗原、激素、腫瘤標(biāo)志物、過(guò)敏原、心肌損傷標(biāo)志物和凝血因子等。
熒光抗體技術(shù)的一種特殊應(yīng)用是流式細(xì)胞分析。在這種分析方法中檢測(cè)儀器不是熒光顯微鏡，檢測(cè)對(duì)象不是固定了的標(biāo)本。而是將游離細(xì)胞作熒光抗體特意染色后，在特殊設(shè)計(jì)的儀器中通過(guò)噴嘴逐個(gè)流出，經(jīng)單色激光照射發(fā)出的熒光信號(hào)由熒光檢測(cè)計(jì)檢測(cè)，并自動(dòng)處理數(shù)據(jù)。這種方法可用于檢測(cè)細(xì)胞大小、粘滯度等，更常用于T細(xì)胞亞群等的檢測(cè)[3-5]。
參考文獻(xiàn)：
[1] 賀天輝.免疫學(xué)檢驗(yàn)技術(shù)的研究進(jìn)展,中國(guó)現(xiàn)代醫(yī),201l.49 (6):14-l5.
[2] 趙晨,張亮,倪原.熒光偏振技術(shù)在生命科學(xué)中的研究進(jìn)展現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2010,16 (10):3154-3156.
[3] 戴維德,顧瑛,劉凡光,等.熒光探針在光動(dòng)力療法亞細(xì)胞損傷位點(diǎn)研究中的應(yīng)用[J].激光生物學(xué)報(bào),2004,13（2）:148-153.
[4] 王浩丹,周申,主編.生物醫(yī)學(xué)標(biāo)記示蹤技術(shù)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社,1995:69-96.
[5] 韓俊偉,杜海燕.免疫熒光技術(shù)原理及應(yīng)用[J].河南畜牧獸醫(yī)，2014，35（11）：9-10.
